来源：中国实验动物信息网

经过科学家多年研究，人源化动物发展日新月异，那么，人源化动物在国内应用现状、需要攻克哪些技术难关、未来发展趋势如何呢？带着这些问题，中国实验动物信息网特邀第四军医大学实验动物中心张海副教授就当前研究现状、难点和未来发展方向进行了详细解答，相信此次张教授的深入讲解对关注人源化动物最新进展的科研工作者将有很大借鉴和帮助。

张海：人源化动物是指体内带有功能性的人类基因、细胞或组织的实验动物。上世纪八、九十年代开始研究者将人PBMC、胎儿胸腺等移植到裸鼠、NOD-SCID小鼠等免疫缺陷动物，建立了携带有人组织/器官的嵌合体动物，移植的人组织/器官可以在受体动物中生长，因此也会产生人病理、生理反应。此类动物可以说是人源化动物的雏形。但由于移植物在动物体内存活时间短，只能局部反应人种属特点，因此其应用范围有限。进入二十一世纪后，随着体外同源重组技术和胚胎干细胞技术的不断完善，人源化动物发展也日新月异，目前已有多个不同品种、品系的人源化动物供生物医学研究应用。

人源化动物是在免疫缺陷动物的基础上建立起来的。由于免疫系统缺失，来源于人的移植物才可在免疫缺陷动物体内存活。在人源化动物研究之初，自发性免疫缺陷裸小鼠是研究者常用的工具；随之，免疫缺陷程度更高的SCID、NOD-SCID小鼠成为研究者的新宠，广泛用于人源化动物的研究。但不管是裸小鼠还是SCID小鼠，其免疫缺陷程度有限，无法从根本上解决移植物在受体动物长时间存活的问题。

随着体外同源重组技术和胚胎干细胞技术的不断完善，研究者将免疫相关基因进行突变，导致动物免疫功能低下、免疫缺陷程度更高，更有利于移植物在该类动物机体存活。目前常见的人源化动物就是在不同品种、品系动物机体内敲除scid、prkdc、rag2、 IL2rg、β2m及 Prf1等基因后导致动物免疫功能下调，然后将人CD34+造血干细胞、胎肝组织、胸腺组织等移植到此类动物后构建而成。与传统的裸鼠、SCID及NOD-SCID小鼠相比，基因工程免疫缺陷小鼠由于敲除了免疫相关基因，免疫缺陷程度更高，不仅T、B细胞缺失，而且NK细胞功能也缺失，更易于移植物在体内存活。以人源化小鼠为例，一般是将人免疫系统和/或肝脏系统移植到上述免疫缺陷动物后构建而成。目前这方面的明星鼠是以JAX公司的NOG、NSG小鼠及Taconic公司的hGM-CSF/hIL3-NOG小鼠为代表，在人源化动物研究中得到广泛应用。

张海：前已论述人源化动物发展基础依赖于免疫缺陷动物，因此通过免疫缺陷动物发展简史可以了解下国外人源化动物发展现状。1966年，研究者首先发现了Foxn1基因突变后小鼠T细胞发生缺陷，免疫缺陷动物从此诞生，1983年研究者又发现prkdc基因突变后导致小鼠T、B细胞功能下降，由此诞生了严重联合免疫缺陷的SCID小鼠，将人PBMC及干细胞移植SCID小鼠后可建立人源化hu-PBL和hu-HSC小鼠模型，这两个模型是人源化动物研究的雏形。但SCID小鼠移植PBL后免疫排斥反应依然严重，人造血干细胞（HSCs）移植后T细胞在SCID小鼠机体重建性差，从而限制了这两类动物的应用。上世纪八十年代研究者发现非肥胖症糖尿病小鼠（nonobese dibetic mice, NOD）先天性免疫应答水平较低，随之研究者将NOD小鼠与SCID小鼠杂交后形成NOD-SCID小鼠。与SCID小鼠相比，NOD-SCID小鼠不仅T、B细胞功能缺陷，而且NK细胞功能低下，所以NOD-SCID小鼠成为人源化动物研究的新宠，但免疫渗漏现象常限制NOD-SCID小鼠在人源化动物研究中的应用。此后研究者一直在努力寻找免疫缺陷程度更高、免疫包容性更强、可替代NOD-SCID小鼠的免疫缺陷动物。

体外同源重组技术和胚胎干细胞技术的发展揭开了人源化动物发展的新篇章。上世纪九十年代研究者发现rag1、rag2基因突变后导致VDJ基因不能重排，从而影响小鼠T、B细胞功能；β2m及Prf1基因突变后又可影响NK细胞功能。于是研究者利用基因打靶技术分别敲除了小鼠的rag、β2m或Prf1基因构建免疫缺陷动物，但这些动物残存的免疫功能依然影响移植物的存活。IL2rg基因编码NK细胞功能，同时IL2rg基因与IL-4、IL-7、IL-15及IL-21细胞因子共享rIL2rg基因突变后，不仅NK细胞功能改变，而且IL-4、IL-7、IL-15及IL-21等细胞因子功能也会缺失。目前的人源化动物就是在rag基因及IL2rg基因突变的基础上发展而来，当小鼠rag基因及IL2rg基因同时突变时，小鼠T、B细胞及NK细胞功能障碍，不会产生T、B细胞介导的细胞免疫应答、体液免疫应答及NK细胞介导的细胞毒效应，同时小鼠巨噬细胞及树突状细胞功能低下。这类动物免疫缺陷程度更高、免疫包容性更强，更适宜于移植物的存活。研究者已在不同遗传背景的BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠及NOD-SCID小鼠中敲除了rag、IL2rg基因，构建了免疫缺陷程度不同的人源化动物，其中从NOD-SCID小鼠发展而来的NOG、NSG小鼠由于其免疫缺陷程度更高，是目前人源化动物研究的明星小鼠；而来自于BALB/c背景的BRG小鼠在很多研究领域也得到广泛应用。

从应用角度来看，人PBMC、CD34+造血干细胞、骨髓等组织、细胞移植上述免疫缺陷动物后可在动物体内重建人免疫系统，该类模型广泛用于肿瘤、感染与免疫、寄生虫、神经生物等与免疫相关领域的研究工作。也有研究者将人骨髓、肝及胸腺等同时移植到BALB/c小鼠来源的免疫缺陷动物构建人源化BLT动物用于生物医学研究。在病毒研究领域，HCV和HBV一直没有良好的小动物模型，Fah-/-小鼠与rag、IL2rg基因突变的C57BL/6小鼠杂交后培育而成的FRG小鼠可用于HCV和HBV研究。Fah突变后，小鼠肝细胞损伤，将人胎肝及免疫组织移植到FRG小鼠后可在其体内重建人肝脏系统，这类人源化动物用于HCV和HBV研究有独特优势。

张海：我国对人源化动物研究和应用较为重视，早在2009年国家科技部就投入资金开展这方面的研究工作，经过多年的发展，已建立了多个具有独立知识产权的人源化动物品种/品系。但与国外相比，我国人源化动物发展水平仍明显落后。

我国开发的人源化动物品种/品系：我国政府和科学家一直对人源化动物研究工作非常工作重视。自从国外报道人源化小鼠以后，我国科学家就积极开始了这方面的研究工作以开发具有独立知识产权的人源化动物。从整体水平来看，尽管我国人源化动物研究起步晚，但进展较快，目前在这方面已经取得很大成功。北京维通达公司开发的具有独立知识产权的NPG和URGTM小鼠，在国内得到广泛应用。

2010年以后随着TALEN及CRISPR/Cas9技术的发展，更是加快了人源化动物研究的步伐。南京大学模式动物研究所采用CRISPR/Cas9技术敲除了NOG/shi小鼠prkdc及IL2rg基因，构建了高度免疫缺陷的NCG小鼠。TALEN和CRISPR/Cas9技术的应用无物种限制，同样可在大鼠、兔及非人灵长类动物中实现靶基因的快速敲除。我国科学家利用该技术又敲除了兔、大鼠及食蟹猴的rag或IL2rg，这些研究为人源化动物多样性奠定了良好的基础。

张海：与传统实验动物相比，人源化动物有诸多优势，因此人源化动物应用范围较广，肿瘤学、血液学、微生物学、器官移植及免疫学等研究领域应用人源化动物后已取得了一批重大研究成果。具体到我国，以裸鼠、NOD-SCD小鼠制备人源化动物报道已屡见不鲜，然而以基因工程免疫缺陷小鼠为基础的人源化动物应用受到很大限制，尽管有许多生物医学研究者对这类动物非常青睐，但其应用范围仍然有限。经过medline检索后发现，目前国内也只有极少数单位，如中山大学、第二军医大学及第三军医大学等有使用NSG、Fah-/-Rag2-/-及NOD.β2mnull.HHD人源化小鼠进行研究的报道。分析原因，有以下几个因素限制了人源化动物在我国的应用。一是人源化动物的基础是免疫缺陷动物，而免疫缺陷动物饲养要求较高，空气洁净度必须达到万级以上，甚至有些地区达到百级以上方能满足其饲养要求，这无形中限制了人源化动物的应用。二是目前人源化动物购买成本较高。据了解，人源化小鼠国内售价每只至少在600元以上。相对于传统实验动物来讲，购买成本较高，从而限制了人源化动物的应用。三是由于知识产权的原因，国外公司如JAX、Taconic、CIEA公司等目前还未开拓中国市场，这些公司的人源化动物在国内还无法采购。四是国内开发的具有独立知识产权的人源化动物生物学特性仍存在一定问题，从而影响了人源化动物的应用。

张海：经过多年的发展，人源化动物呈现出良好的应用前景，在多个研究领域得到广泛应用。但我们仍需清醒地认识到，目前的人源化动物还存在一些问题，不能完全满足生物医学研究的应用，未来人源化动物发展还有许多难关需要克服。一是就实验动物自身而言，仍需对其不断进行基因修饰以提高移植物存活率。具体来讲，就是要在目前免疫缺陷的基础上或通过基因敲除的方法去除其它决定移植物抗宿主反应的分子；或通过基因敲入的方法将一些决定免疫细胞功能的分子导入到免疫缺陷动物以提高人免疫细胞在动物体内增殖、分化。目前在这方面已经取得一些进展，如巨噬细胞表面的SIRPα和CD47分子形成的复合物影响HSCs在免疫缺陷动物体内增殖，NOG小鼠中CD47分子敲除后可增强HSCs在其体内增殖与分化。红细胞生成素（TPO）、hGM-CSF、hIL-3、hIL-2及hIL-4敲入到NSG小鼠后可明显提高HSCs或NK细胞在动物体内增殖、分化。但目前困扰我们的是，尽管通过敲入或敲除的方法对这些免疫缺陷动物进行了基因修饰，似乎仍无法找到一个理想的模型，因此未来人源化动物发展仍需发现一些关键分子并在动物水平上对其进行基因修饰以提高移植物的存活率。二是就移植物而言，HSCs移植到受体动物后，HSCs在动物机体增殖、分化程度低，且缺少细胞与细胞间的反应，在这些动物体内只能部分重建人免疫系统。目前有研究者尝试通过改变HSCs接种途径、选择不同组织来源HSCs（脐带血、胎肝组织、骨髓等）或通过慢病毒包装HSCs的方法以提高其在动物体内增殖、分化程度。尽管这些研究已经取得一定程度进展，但要在这些动物体内最大程度重建人免疫系统仍需要对HSCs进行不断探索。

近年来，胚胎干细胞及iPS的发展为人源化动物制备提供了有力的支撑条件，相信未来通过移植胚胎干细胞及iPS方法可为研究者提供更多、更理想的携带有人组织/器官动物出现。

张海：随着生物医学研究的发展和我国科技投入力度的不断加大，人源化动物在国内将会有极大的发展前景，使用数量将会急剧增大，应用范围也会越来越广。未来人源化动物在我国的应用将呈现以下发展趋势：一是将会有更多的不同品种/品系的人源化动物可供国内研究者使用。随着TALEN及CRISPR/Cas9技术的不断改进，人源化动物制备将会变得更为简便、快捷，将会有更多人源化动物被开发应用。据了解，除上述国内已开发的人源化动物品种/品系外，目前国内还有很多单位正在积极开展这方面的研究工作，如中国食品药品检定研究院的rag2基因敲除大鼠模型、中国科学院广州生物医药与健康研究院rag基因敲除兔模型及第四军医大学rag2、IL2rg双基因敲除的BALB/c小鼠模型等，相信不久以后，这些模型会丰富我国人源化动物的研究，可为生物医学研究提供良好的实验工具；二是人源化动物与人相似度将会越来越高。目前的人源化动物尚不能完整模拟人病理、生理反应，但随着生物医学的发展，一些新技术和新方法的应用可以克服目前人源化动物的缺陷，这将会促进人源化动物的应用。三是从人源化动物应用来看，未来国内对人源化动物需求将会越来越多，这不仅表现在人源化动物数量的提升，而且表现在人源化动物质量的加强。

人源化动物自应用以来，极大地促进了生物医学的发展。我国人源化动物研究起步晚，但进展较快，已有多个独立知识产权的不同品种/品系人源化动物供生物医学应用。尽管目前人源化动物在我国的应用范围有限，但随着生物医学的发展和我国科技投入力度的不断加大，人源化动物在我国将会有极大的应用前景。

张海副教授

现任陕西省实验动物质量监督检测中心及第四军医大学实验动物中心副教授、副主任，陕西省实验动物学会秘书长，全军实验动物专业委员会委员、陕西省医学会微免学会委员。2001年获第四军医大学实验动物学硕士学位，2005年获第四军医大学微生物学博士学位，2010-2012年美国FDA访问学者。

主要从事肿瘤自噬及人类疾病动物模型研究工作，发现一些抗肿瘤药物可通过抑制Sonic Hedgehog分子表达而调控自噬的形成；近年来，积极探索人源化动物研究工作，利用CRISPR/Cas9技术敲除BALB/c小鼠rag2及IL2rg基因，该项工作目前进展顺利，正在筛选F2代纯合子小鼠。

主持国家自然科学基金面上项目、陕西省科技服务平台建设及陕西省自然科学基金各一项。作为主要参与者参加国家重大传染病专项研究课题1项，"863"课题2项及国家自然科学基金多项等研究工作。获中国实验动物学会三等奖及陕西省教学成果一等奖各1项，发表论文30余篇。